سه شنبه 31 ارديبهشت 1398 Tuesday 21 May 2019 16 رمضان 1440

کارشناسان این شرکت شما را در جهت طراحی و سنتز انواع پرایمر یاری خواهند نمود لذا در صورت نیاز با شرکت آرین اندیش تماس حاصل فرمائید

در حال‌ حاضر پرايمر بيش‌ از هر عامل‌ ديگري‌ عامل‌ موفقيت‌ يا شكست‌ در يك‌ واكنش‌pcr ‌ است. بعضي‌ قواعد راهنمايي‌هاي‌ مفيدي‌ را در مورد طراحي‌ آغازگر مي‌كنند كه‌ به‌ آنهااشاره‌ شده‌ است.
- طول‌ متوسط‌ هر پرايمر بين‌ 1
7- 27 جفت‌ باز نوکلئوتید است طول‌ كوچك‌ اتصال‌ غيراختصاصي‌ را افزايش‌ و پرايمر بزرگتر سرعت‌ هيبريداسيون‌ را كم‌ مي‌كند.
مقدار
G-C دو پرايمر با هم‌ مشابه‌ بوده‌ و حدود 50-60 درصد باشد.
- پرایمرها ها
F, R بايد از نظر مكمل‌ بودن‌ با هم‌ كنترل‌ شوند.
‌‌‌‌پرايمر يك‌ رشته مصنوعي‌ است‌ كه‌ اغلب‌ برای شروع واکنش
PCR ‌ لازم می باشد پرايمر.

در انتهاي‌ َ3 پرايمر بايد حداقلC ‌ ياGقرار گيرد در توالي‌هائي‌ پرايمرهائي‌ كه‌ انتهاي‌ َ3 آنها غني‌ا زG+C مي‌باشد احتمال‌ اتصال‌ اشتباهي‌ افزايش‌ مي‌يابد
- بايد تا حد امكان‌ از تواليهاي‌ پاليندروميك‌ داخل‌ پرايمرها جلوگيري‌ كرد.
- نسبت‌ چهار نوكلئوتيد در آغازگر حتي‌المقدور يكسان‌ باشد.
- آغازگر به‌ توالي‌ تكرار شونده‌ ختم‌ نشود.
- دماي
Tm ‌ دو آغازگر نزديك‌ هم‌ باشد .
- حدمجاز دماي‌ اتصال‌ پرايمر طراحي‌ شده‌ بايد بين‌ 65-55 باشد. دماي‌ تكثيرايده‌آل‌ 62-72مي‌باشد.
‌‌‌‌درجه‌ حرارتي‌ كه‌ پرايمر به
DNA ‌ الگو متصل‌ مي‌شود به‌ طول‌ آغازگر و مقدارGC آن‌ بستگي دارد براي‌ پرايمرهاي‌ حاوي GC ‌50% و داراي‌ 20 نوكلئوتيد، دماي‌ 55 درجه‌ سانتيگراد پيشنهادمي‌شود براي‌ افزايش‌ اختصاصي‌ عمل‌ كردن‌ آغازگر حتي‌ ممكن‌ است‌ دماهاي‌ بالاتري‌ هم‌ موردنيازباشد.
‌‌‌‌براي‌ اينكه‌ هر پرايمر با رشته‌ الگوي‌ خودش‌ هيبريد شود لازم‌ نيست‌ كه‌ عينا و كاملا مكمل رشتهِ الگو باشد براي‌ طراحي‌ پرايمر اغلب‌ از برنامه‌هاي‌ كامپيوتري‌ ويژه‌ استفاده‌ مي‌شود فاصله‌ بين‌پرايمرهايي‌ كه‌ با
DNAي‌ هدف‌ هيبريد مي‌شود بطور معمول‌ كمتر از 15 كيلو باز مي‌باشد.‌‌‌‌در حقيقت‌ يك‌ كاهش‌ اساسي‌ در سنتز موِثر هنگامي‌ كه‌ محصول‌ تكثير متجاوز ا زb 1000مي‌شود، مشاهده‌ مي‌گردد. به‌ همين‌ دليل‌ طول‌ قطعه‌ مورد تكثير درPCRنبايد بيش‌ ازKb3 باشد وحدمطلوب‌ كمتر ازKb1مي‌باشد ‌‌‌‌تكثير قطعات‌ بسيار طويل‌ و بالايKb ‌40 مقدور است‌ اما نياز به‌ روشهاي‌ ويژه‌اي‌ دارد.

دماي‌ ذوب‌ آغازگر
‌‌‌‌دماي‌ اتصال‌ بايد بقدر كافي‌ پايين‌ باشد تا پرايمر و
DNA الگو قادر به‌ اتصال‌ باشند و از سوي ديگر بايد به‌ قدر مناسب‌ بالا باشد تا از تشكيل‌ اتصالات‌ غيراختصاصي‌ جلوگيري‌ كند. دماي‌ اتصال‌از روي‌ شاخصي‌ به‌ نام‌ درجه‌ حرارت‌ ذوب‌ محاسبه‌ مي‌شود. دماي‌ ذوب‌ درجه‌ حرارتي‌ است‌ كه‌ درآن‌ نيمي‌ از DNAبه‌ صورت‌ تك‌ رشته‌اي‌ درآمده‌ است. يكي‌ از مهمترين‌ مشخصاتTm ‌وابستگي‌ آن‌ به‌ تركيب‌ بازيDNA ‌ استG. وC سه‌ پيوند هيدروژني‌ و بازهاي‌ آدنين‌ و تيمين‌ دوپيوند هيدروژني‌ دارند. بنابراين‌ هر چقدر مقدار گوانين‌ و سيتوزين‌ درDNAبيشتر باشدTmبيشتراست. دماي‌ 2-1 درجه‌ سانتيگراد كمتر ازTmكافيست‌ كه‌ هيبريداسيون‌ بين‌ پرايمر وDNAي‌ الگودر آن‌ صورت‌ گيرد. دماي‌ ذوب‌ بطور معمول‌ از طريق‌ فرمول‌ سادهِ زير نيز محاسبه‌ مي‌شود.

c ‌‌0Tm = ]4 * (G + C) + 2 * (A + T) براي‌ هر پرايمر 20 نوكلئوتيدي‌


‌‌‌‌دو پرايمر بايد طوري‌ طراحي‌ شوند كه‌ دارايTm ‌ يكسان‌ باشند در غير اينصورت‌ درحرارت‌ مناسب‌ براي‌ يك‌ پرايمر براي‌ جفت‌ ديگر نامناسب‌ خواهد بود.‌‌‌‌بسياري‌ از آزمايشگاهها دماي‌ چسبيدن‌ را از 5-3 درجه‌ سانتيگراد زير دماي‌ ذوب(Tm) ‌ كه‌ طريق‌ اين‌ فرمول‌ محاسبه‌ شده‌است‌ درنظر مي‌گيرند. از اين‌ موضوع‌ نتيجه‌ گرفته‌ مي‌شود

پرايمرهاي‌ با طول‌ زياد باعث‌ افزايش‌ بالا رفتن‌ اختصاصي‌ بودن‌ واكنش‌ نمي‌شود.

غلظت‌ پرايمرها و روش‌ اندازه‌گيري‌ آن‌
‌‌‌‌غلظت‌ پرايمر بين‌ 50/0 تا 5/0 ميكرومول‌ و حد مطلوب‌ 6/0 - 1/0 براي‌ يك‌ واكنش25 ميكروليتري‌ مي‌باشد. غلظت‌ بالاي‌ پرايمر باعث‌ بسط‌ غيراختصاصي‌ و پرايمر- دايمر مي‌شود.بعضي‌ از منابع‌ روش‌ زير را براي‌ محاسبه‌ غلظت‌ پرايمر پيشنهاد كرده‌اند‌‌‌‌براي‌ انجام‌ اين‌ محاسبه‌ ابتدا لازمست‌ كه‌ ضريب‌ تكثير مولي‌ پرايمر در 260 نانومتر محاسبه شود كه‌ غلظت‌ مولي‌ مي‌تواند با استفاده‌ از فرمول‌ زير محاسبه‌ شود.روش‌ ديگر محاسبه‌ براساس
OD ‌4مي‌باشد.

اتصال‌ پرايمر
‌‌‌‌دما و مدت‌ زمان‌ لازم‌ براي‌ اتصال‌ پرايمر به: 1) طول‌ پرايمر، 2) تركيب‌ نوكلئوتيد3) غلظت‌ پرايمر بستگي‌ دارد.‌‌‌‌با توجه‌ به‌ طيف‌ فعاليت‌ آنزيم
Taq ‌ پلي‌مراز كه‌ در محدوده‌ 58-02 درجه‌ سانتيگراد مي‌باشددماي‌ اتصال‌ در محدودهِ 72-55 درجه‌ سانتيگراد بطور معمول‌ بهترين‌ نتيجه‌ را مي‌دهد افزايش‌دماي‌ اتصال‌ بسط‌ غيراختصاصي‌ را در انتهاي‌ َ3 پرايمر كاهش‌ مي‌دهد. دماي‌ پايين‌ تكثير همراه‌ باغلظت‌ اختصاصي‌ بودن‌ واكنش‌ را كاهش‌ مي‌دهد

بسط‌ پرايمر
‌‌‌‌مدت‌ زمان‌ بسط‌ بستگي‌ به‌ عوامل: 1) طول‌ توالي‌ هدف، 2) غلظت‌ توالي‌ هدف‌ و 3) دماي تكثير دارد.‌‌‌‌بسط‌ پرايمر بطورمعمول‌ دردماي‌ 72 درجه‌ سانتيگراد انجام‌ مي‌شود يك‌ زمان‌ بسط‌ دقيقه‌اي‌ در 72 درجه‌ سانتيگراد براي‌ فرآورده‌هاي‌ معادل‌ 2 كيلو باز كافيست‌

طراحی سایت توسط دارکوب | هاست دارکوب